La citometria di flusso rappresenta un importante metodo d’indagine per i laboratori di ricerca ed ha anche un ruolo vitale nei laboratori di diagnostica "in vitro". Tale tecnica consente di reperire informazioni riguardanti la struttura, la funzione e l’interazione delle cellule nei processi di sviluppo delle malattie. Il suo ampio successo dipende da molteplici vantaggi che essa offre, permettendo di misurare contemporaneamente più parametri in diverse migliaia di cellule al secondo. La citofluorimetria è una metodica essenziale per l’analisi citologica quali-quantitativa e, sfruttando l’attività di anticorpi monoclonali, riesce a separare in una sospensione eterogenea diverse sottopopolazioni di cellule con una purezza superiore al 95%.

Questa tecnica di analisi viene applicata nella routine di laboratorio tramite l’utilizzo di strumenti denominati citofluorimetri che trovano impiego in diversi settori della medicina e della biologia cellulare.

Le applicazioni principali sono di seguito indicate:

• studio del ciclo cellulare.

• studio degli antigeni di membrana

• valutazione della vitalità della funzionalità mitocondriale e della perossidabilità cellulare

• analisi statistica di parametri biologici in oncologia

• studio dei flussi ionici, principalmente del Calcio

• lavori di routine ematologia, immunologia, microbiologia, genetica

• sorting (con un sistema di flessione del tipo carica/campo elettrico si ottiene una relazione cellulare di elevata purezza del campione selezionato)

Attualmente in commercio sono reperibili citofluorimetri di tipo "analizer" e di tipo "cell sorter", che, a differenza dei primi, effettuata l’analisi, conservano il campione per eventuali successive indagini.

I modelli presenti attualmente sul mercato si differenziano inoltre in semiautomatici, nei quali il campione deve essere precedentemente preparato, ed automatici, che lavorano in completo automatismo.

I principi di funzionamento nel citofluorimetro sono essenzialmente light scattering (diffusione luminosa), fluorescenza ed impedenza elettrica.

Questa apparecchiatura è costituita dai seguenti elementi base:

• circuito fluidico

• unità di conteggio e misura

• separatore cellulare

• unità di controllo ed elaborazione dati.

Il circuito fluidico oltre all’aspirazione preparazione e movimentazione del campione e dei reattivi provvede anche al lavaggio e scarico dei prodotti finali. Le cellule in sospensione sono iniettate in una guaina fluidica di solito costituita da una soluzione isotonica che viene mantenuta a pressione opportuna mediante pompe peristaltiche od a membrana.

L’unità di conteggio e misura è costituita da sorgenti di radiazioni tipo laser ad elio-neon o ad argon oppure da una lampada a vapori di mercurio. I laser sono preferiti in quanto producono una radiazione ad alta intensità, coerente e perfettamente monocromatica. La deflessione del raggio e l’emissione dei fotoni provocate dall’interazione raggio-particelle vengono registrate e convertite da fotoamplificatori in segnali di analisi.

Il separatore cellulare detto anche sorter non è presente in tutti i modelli. I sorter tradizionali prevedono che il campione fluido venga frammentato in minuscole goccioline, ognuna delle quali contiene una cellula. Le gocce che contengono cellule con caratteristiche rientranti nei parametri prefissati si presentano elettricamente cariche ed indirizzate in appositi raccoglitori da placche di deflessione. Nei modelli più recenti i sorter sono definiti "catcher tube" e sono posizionati nella camera di flusso al di sopra dell’intercetta raggio luminoso/cellula. Lo strumento decide rapidamente se la cellula che passa il raggio risponde ai parametri impostati, quindi la cattura e la deposita in tubi di raccolta.

L’unità di controllo ed elaborazione dati provvede a visualizzare i dati d’analisi ottenuti sotto forma di istogrammi o logaritmici; esistono anche dei software che calcolano, analizzano, immagazzinano ed esportano direttamente un gran numero di dati.